L'istituzione di una biblioteca fornita di una "quantità bastante di libri di tutte le scienze", e dotata di apposita regolamentazione, risale a Pedro Fernandez de Castro, conte di Lemos, viceré di Napoli dal 1610 al 1616, sul modello dell'Università di Salamanca. ll Palazzo degli Studi, a lavori non ancora ultimati, venne inaugurato il 14 giugno 1615. Carlo di Borbone, una volta asceso al trono di Napoli nel 1734, ordinò la ripresa dei lavori del Palazzo degli Studi; le misure adottate negli anni seguenti mirarono a restituire al complesso universitario decoro e funzionalità fino al suo definitivo trasferimento, nel 1777, all'interno del soppresso Collegio Massimo dei Gesuiti al Salvatore. Con la soppressione degli ordini religiosi, decretata dal governo di Giuseppe Bonaparte nel 1806, la Regia Università degli Studi accolse grandi quantità di libri già appartenuti ai monasteri e destinati al Collegio Reale. All'indomani dell'Unità d’Italia, l'Universitaria entrò nel novero delle biblioteche governative di prima classe. Nel tempo, si arricchì delle raccolte di Filippo e Carlo Cassola (chimica), di Francesco Briganti (scienze naturali), di Paolo Panceri (zoologia e anatomia comparata), di Oronzo Gabriele Costa (paleontologia), di Celestino Cavedani (filologia e archeologia). Pure rilevanti sono: la collezione dantesca donata, nel 1872, da Alfonso della Valle di Casanova, ricca di antiche e pregevoli edizioni; la raccolta di Vittorio Imbriani, di prevalente interesse letterario e linguistico; la cospicua raccolta di opere e opuscoli a carattere giuridico e letterario offerta, negli ultimi dell’Ottocento, da Domenico Viti e Domenico De Pilla. Nei primi anni del Novecento vennero accolte e catalogate le donazioni Padelletti, Battaglini (matematica) e Aievoli (medicina) che rafforzarono la sua identità scientifica. Restaurata dopo il terremoto del 1930 la Biblioteca subì, nell'ultimo conflitto mondiale, seri danneggiamenti e la perdita di pregevoli cinquecentine, bodoniane e volumi del fondo Casanova ricoverate nel Convento dei Frati Minori di S. Francesco a Minturno. Dopo il terremoto del 1980 numerosi interventi di restauro e di consolidamento hanno consentito il potenziamento delle attrezzature e un notevole rinnovamento dei servizi e delle strutture che ne hanno modernizzato la fruizione.